Ключевой результат исследования
Определение ДНК ВПЧ в моче существенно зависит от метода забора материала и чувствительности используемого теста. Стандартизированный сбор первой порции мочи с помощью устройства Colli-Pee в сочетании с ПЦР обеспечил наилучшую детекцию — чувствительность 60% (9/15) при специфичности 100%.
Это препринт (preprint), не прошедший рецензирование в журнале. Результаты требуют валидации в крупных проспективных исследованиях.
Статус публикации
Данная работа является препринтом (DOI: 10.21203/rs.3.rs-10526938/v1), статус — «Under Review». Она не прошла экспертную оценку (peer review) в рецензируемом журнале. Результаты следует интерпретировать с осторожностью.
Введение и обоснование
Рак шейки матки остаётся серьёзной проблемой глобального здравоохранения, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. Персистирующая инфекция высокоонкогенными типами ВПЧ является основным этиологическим фактором и ответственна за более чем 95% случаев цервикального рака.
Тестирование ДНК ВПЧ в моче рассматривается как неинвазивная альтернатива цервикальному забору. Первая порция мочи содержит эксфолиированные клетки шейки матки и влагалища, что делает её потенциально пригодным материалом для детекции ВПЧ. Однако гетерогенность методов сбора мочи, отсутствие стандартизированных протоколов и в целом более низкий выход ДНК по сравнению с цервикальными образцами ограничивают внедрение метода в рутинную клиническую практику.
Устройство Colli-Pee разработано для стандартизированного сбора именно первой порции мочи с одновременной стабилизацией нуклеиновых кислот. Индийские данные по сравнению различных методов определения ВПЧ в моче при стандартизированном заборе первой порции ограничены.
Дизайн и методология
Пилотное кросс-секционное исследование проведено на базе отделений акушерства и гинекологии, микробиологии и лабораторной онкологии Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS), Нью-Дели, с 19 января 2024 г. по 20 ноября 2025 г.
Популяция исследования
Критерии включения: женщины старше 25 лет, обратившиеся в амбулаторное отделение. Критерии исключения: проведённый скрининг рака шейки матки в течение предшествующих трёх лет (цитология) или вагинальное кровотечение.
Этическое одобрение получено от институционального этического комитета (IEC, номер: AIIMSA00216/13.12.2023, RT-07/18.01.2024). Исследование проведено в соответствии с ICH-GCP, рекомендациями ICMR и руководством New Drugs and Clinical Guidelines-2019. Информированное согласие получено от всех участниц.
Забор материала
Из 253 женщин, прошедших скрининг на ДНК ВПЧ шейки матки методом Digene HC2, 15 оказались ВПЧ-положительными. Эти 15 женщин и 15 подобранных по возрасту ВПЧ-отрицательных контролей составили группу для оценки мочевого тестирования (n=30).
У всех 30 участниц собирали первую порцию мочи двумя способами:
- Одноразовый контейнер для посева мочи (примерно 20–30 мл) — утром одного дня
- Устройство Colli-Pee (объём сбора 20 мл) — утром следующего дня
Молекулярные методы
Аликвоты каждого образца мочи обрабатывались независимо для трёх тестов:
Hybrid Capture-2 (HC-2): Экстракция ДНК — набор QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Обработка 200 мкл мочи, элюция в 50 мкл буфера AE. Тест детектирует 13 типов ВПЧ высокого риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) методом РНК-ДНК гибридизации с хемилюминесцентной амплификацией сигнала.
ПЦР (PCR): Экстракция ДНК — набор TRUPCR Tissue DNA Extraction Kit (3B BlackBio Biotech India Ltd.). Протеиназа K + колоночная очистка. Элюция в 35–50 мкл, концентрация ДНК 7–20 нг/мкл, соотношение A260/A280 1,9–2,0. Тест TRUPCR HPV High-Risk Genotyping Assay на платформе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System. Детектирует 14 типов ВПЧ высокого риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68), мишень — онкогены E6/E7, зонды TaqMan. Объём реакции 30 мкл (25 мкл мастер-микс + 5 мкл ДНК). Термоциклирование: 95°C — 10 мин, затем 40 циклов (95°C — 15 с, 60°C — 60 с). Аналитическая чувствительность — примерно 100 МЕ/мл.
Line Probe Assay (LPA): Набор INNO-LiPA HPV Genotyping Extra II (Fujirebio Europe, Бельгия). Экстракция ДНК — QIAamp DNA Mini Kit. Амплификация праймерами SPF10, нацеленными на консервативный 65 п.н. фрагмент региона L1 ВПЧ. Обратная гибридизация на нитроцеллюлозных стрипах. Тест детектирует 32 генотипа ВПЧ (13 высокого, 7 вероятно высокого и 12 низкого риска). Интерпретация — программное обеспечение LiRAS.
Статистический анализ
Размер выборки для фазы скрининга рассчитан по формуле n = 4pq/d² при распространённости ВПЧ 8% (по данным Sudhakaran et al.) и абсолютной точности 5% при 95% доверительном уровне (минимальный размер — 113 участниц). Для повышения осуществимости и компенсации потенциальных потерь включены 253 участницы. Рассчитаны точные биномиальные 95% доверительные интервалы (Клоппера–Пирсона). Данные анализировались в STATA 15.0. Сравнение базовых характеристик — точный тест Фишера. p < 0,05 считался статистически значимым.
Результаты
Распространённость ВПЧ в скрининговой выборке
Из 253 обследованных женщин 15 (5,9%) оказались положительными на ДНК ВПЧ шейки матки.
Скрининг проводился методом Digene HC2.
Базовые характеристики участниц
Средний возраст был сопоставим в обеих группах: 31,9 ± 6,4 года в ВПЧ-положительной группе против 31,7 ± 5,9 года в контрольной (p = 0,930). Статистически значимых различий по уровню образования, возрасту менархе, использованию контрацепции, сопутствующим заболеваниям и ВИЧ-статусу не выявлено. Все участницы были некурящими, ни одна ранее не проходила скрининг рака шейки матки. Одна участница в ВПЧ-положительной группе была ВИЧ-положительной (6,7%); в контрольной группе ВИЧ-положительных не было (p = 1,000).
Детекция ДНК ВПЧ в моче: стандартный контейнер
Стандартный контейнер: нулевая детекция
Образцы первой порции мочи, собранные в стандартные одноразовые контейнеры, не показали положительных результатов на ДНК ВПЧ ни одним из трёх методов (HC-2, ПЦР, LPA) — 0/15 (0%) в ВПЧ-положительной группе.
Нулевая детекция свидетельствует о неадекватности обычных контейнеров для мочевого ВПЧ-тестирования.
Детекция ДНК ВПЧ в моче: устройство Colli-Pee
Результаты детекции с Colli-Pee (ВПЧ-положительные женщины, n=15)
ПЦР: 9/15 (60,0%), 95% ДИ 32,3–83,7%, специфичность 100%, PPV 100%, NPV 71,4%. LPA: 7/15 (46,7%). HC-2: 3/15 (20,0%).
Ни у одной ВПЧ-отрицательной женщины ДНК ВПЧ в моче не обнаружена ни одним методом — специфичность 100% для всех тестов.
Результаты кольпоскопии
Кольпоскопия выполнена всем 15 ВПЧ-положительным женщинам. Результаты:
- Норма — 13 (86,7%)
- LSIL — 1 (6,7%)
- HSIL — 1 (6,7%)
Направленные биопсии проводились из аномальных участков по системе Swede score; последующее ведение определялось данными кольпоскопии и гистопатологического исследования.
Обсуждение и клиническое значение
Исследование продемонстрировало критическое влияние метода забора мочи на результаты тестирования. Стандартные контейнеры для посева мочи не обеспечили детекцию ДНК ВПЧ ни в одном случае, тогда как стандартизированный сбор первой порции устройством Colli-Pee позволил выявить ВПЧ у части инфицированных женщин.
Среди трёх молекулярных методов ПЦР показала наивысшую чувствительность (60%), за ней следовали LPA (46,7%) и HC-2 (20%). Все методы продемонстрировали 100% специфичность — ложноположительных результатов в контрольной группе не зафиксировано.
Чувствительность ПЦР в 60% ниже, чем обычно наблюдается при цервикальном заборе, что подтверждает известную проблему сниженного выхода ДНК из мочевых образцов. Тем не менее авторы рассматривают оптимизированное мочевое тестирование как перспективный неинвазивный дополнительный подход к скринингу ВПЧ.
Ограничения исследования
Малый размер выборки (n=30, из них 15 ВПЧ-положительных) ограничивает статистическую мощность и обобщаемость результатов. Широкие доверительные интервалы (например, 95% ДИ для чувствительности ПЦР: 32,3–83,7%) отражают неопределённость оценок. Забор мочи проводился в разные дни (стандартный контейнер — первый день, Colli-Pee — второй день), что может вносить дополнительную вариабельность. Исследование носит пилотный характер и требует валидации в крупных проспективных когортах.
Выводы
Определение ДНК ВПЧ в моче существенно зависит от метода забора образца и чувствительности используемого теста. Стандартизированный сбор первой порции мочи с помощью устройства Colli-Pee в сочетании с ПЦР обеспечивает наибольшую вероятность детекции. Цервикальный забор остаётся референсным стандартом, однако оптимизированное мочевое тестирование представляет собой перспективный неинвазивный комплементарный подход к скринингу ВПЧ, требующий дальнейшей оценки и валидации в более масштабных исследованиях.